7.3. Хранение водорослей (С. П. Вассер, П. М. Царенко)

В зависимости от целей и задач, стоящих перед исследователями при изучении альгологического материала, определяют способ хранения водорослей - в живом, высушенном или фиксированном состоянии и подбирают соответствующий консервант.

Живые музейные культуры хранят на твердых агаровых косяках или иногда в жидких суспензированных питательных средах^* не менее чем в трех экземплярах. Длительность выращивания культуры водорослей без пересева в жидкой среде зависит от различных факторов: темпов роста водоросли, запаса питательных элементов в среде и т. п. На агаризованных средах водоросли растут медленнее, чем на жидких, в связи с этим твердые среды чаще используют для хранения водорослей в музее. Чтобы агаризованная среда с посеянной водорослью не подсыхала, пробирки или колбы после посева плотно закрывают ватно-марлевыми пробками и покрывают колпачком из полиэтилена или пергаментной бумаги. Затем пробирки помещают на 1-1,5 недели на свет для нарастания клеток. Обычно для хранения музейных культур на агаровых косяках используют холодильный шкаф с температурой 6-16°С, освещаемый слабым источником света в 300-500 лк (люминесцентная лампа или лампа накаливания в 15-25 Вт). В таких условиях культуры можно хранить довольно долго, если их периодически (через 1-3 месяца, в зависимости от специфики объекта) пересевать на свежие питательные среды. Например, синезеленые водоросли допустимо не пересевать длительное время (1-1,5 года), а зеленые - только 1-2 месяца, диатомовые - до месяца, хотя и эти сроки весьма ориентировочны.

^* (Описание питательных сред см. в разделе 7.2.)

Длительно выдерживать водоросли без пересева не рекомендуется, так как даже на богатой питательной среде водоросли могут прекратить рост в результате самоотравления (автоингибирования) продуктами своей жизнедеятельности. Признаками угнетения жизнедеятельности водоросли и прекращения роста могут быть пожелтение культуры, появление белесого оттенка на среде или ее помутнение.

Каждый штамм водоросли хранят в коллекции под определенным номером и снабжают паспортом, в котором указывается его систематическая принадлежность, фамилия выделившего его исследователя, номер в коллекции этого исследователя, происхождение штамма, дата его выделения, условия дальнейшего выращивания, хранения и поддержания культуры, ее характеристика, а также некоторые другие данные [52, 294].

Для общих систематических исследований и непродолжительного хранения водорослей применяют различные фиксаторы и консерванты. С целью хранения водорослей менее 3 месяцев можно использовать как консервант концентрированный раствор Люголя с добавкой уксуснокислого натрия (10 г KI растворяют в 20 мл дистиллированной воды, а затем добавляют 5 г иода и после чего еще 50 мл воды, в которой растворено 5 г уксуснокислого натрия, и доводят общий объем до 100 мл) или спиртово-глицериновую смесь I (180 мл 96%-го спирта, 80 мл глицерина (х. ч.), 700 мл дистиллированной воды) [651]. Альгологическая проба с одним из указанных консервантов хорошо хранится в пластмассовой посуде, а при необходимости ее дальнейшего хранения требуется введение нового консерванта. Лактофенол (кулактоль) и раствор Кинга относятся к консервантам краткосрочного действия и не изменяют окраски хлоропластов. Состав чистого нейтрального лактофенола следующий: кристаллический фенол - 20 г. молочная кислота - 20 г, глицерин - 40 г, вода дистиллированная - 200 мл.

Кроме чистого лактофенола используют также его смеси с другими фиксаторами или с добавлением солей меди. Так, два раствора, приготовленных раздельно (0,4 г хлористой меди в 100 мл дистиллированной воды и 0,44 г сульфата меди в 100 мл дистиллированной воды) смешивают после полного растворения солей и добавляют 5 мл лактофенола, отстаивают 1-2 дня и фильтруют. Фильтрат должен иметь нежно-голу бой оттенок и его необходимо использовать в течение 1-2 недель. Когда этот консервант приобретает зеленую окраску, он становится негодным к применению. Лактофенол (и его смеси с фиксаторами) пригоден для консервации всех пресноводных водорослей, кроме синезеленых, но особенно хорошие результаты дает при фиксировании зеленых и эвгленовых водорослей. Под воздействием катионов меди содержимое синезеленых водорослей становится мутным и водоросли приобретают коричневый оттенок. В экспедиционных условиях для фиксации водорослей обычно применяют концентрированные растворы (смесь 1 г хлористой меди в 100 мл воды и 1,7 г сульфата меди в 100 мл воды), которые готовят по указанной выше методике и разбавляют мягкой кипяченой или дистиллированной водой в 6-10 раз. В данном консерванте сохраняется форма клетки, зеленая окраска хлоропластов, а также способность крахмала к окраске. Однако необходимым условием приготовления консерванта является химическая чистота реактивов и свежесть самого раствора, а также определенная жесткость воды. Поскольку при добавлении лактофенола к природной жесткой воде часто образуются коричневые слои вокруг водорослей, перед консервацией водоросли необходимо промыть дистиллированной или кипяченой водой и лишь затем добавлять лактофенол.

Раствор Кинга состоит из камфорной воды - 50 мл, дистиллированной воды - 50 мл, ледяной уксусной кислоты - 0,5 мл, сульфата меди - 0,2 г, хлористой меди - 0,2 г. Камфорную воду готовят, оставляя одну фасованную таблетку камфоры в 100 мл воды на 5 дней. Водоросли, выдержанные несколько дней в данном фиксаторе, переносят в консервант - спиртовоглицериновую смесь II (600 мл 96%-го спирта, 80 мл глицерина (х. ч .), 280 мл дистиллированной воды) с добавлением тимола (см. ниже).

Довольно практичным фиксатором оказался метаформ (этаформ), состоящий из 3 частей метилового (этилового) спирта и 1 части формальдегида, который добавляют к пробе в соотношении 1:(5-6). Однако этот фиксатор вызывает легкий плазмолиз содержимого клетки. Добавление ледяной уксусной кислоты предупреждает плазмолиз, но тогда консервант необходимо заменить на следующий день. Кислоту следует добавлять непосредственно перед использованием фиксатора, при этом желательно добавлять водоросли к фиксатору, а не наоборот.

Наиболее распространенным и обычно применяемым в экспедиционных условиях фиксатором является 4%-й нейтральный формалин. Его готовят из покупного формалина, нейтрализуя его содой или мелом (эти вещества добавляют непосредственно в бутыль с формалином) и разбавляя дистиллированной водой в 10 раз, нейтрализуют муравьиную кислоту несколькими каплями насыщенного раствора бикарбоната натрия (х. ч.), добавленными непосредственно в пробу. Аптечный 40%-й формалин используют для консервации в соотношении 1:9 (или приблизительно 20 капель на 10 мл пробы либо около 200 капель на 100 мл). При длительном хранении водорослей в формалине наблюдается некоторое обесцвечивание клеток и они теряют способность к окраске гистологическими красителями, но большинство видов с прочной оболочкой (например, зеленые водоросли порядка Chlorococcales, Desmidiales, а также диатомовые, пирофитовые и т. д.) хорошо определяются после 50 и более лет хранения. В целом, формалин пригоден для хранения всех водорослей, за исключением водорослей с метаболичными клетками. Однако в идеальном случае водоросли, особенно макрофиты, не должны храниться в формалине более 3 дней, после чего их необходимо несколько раз промыть дистиллированной водой или 20%-м спиртом, а для дальнейшего хранения поместить в смесь спирта и глицерина с добавлением тимола (см. ниже).

Равноценным, а в некоторых отношениях более удобным для хранения всех групп водорослей, является раствор Пфайффера (смесь равных частей формалина, метилового спирта и уксусной кислоты). В этом фиксаторе хорошо сохраняется форма водорослей, их органеллы, хлоропласты, а также наружная слизистая оболочка или слизистые влагалища, но он не пригоден для фиксации наиболее нежных жгутиковых форм. Данный раствор добавляют к пробе в соотношении (3-4):1, и после 5-20 ч фиксации водоросли промывают в воде до исчезновения запаха уксусной кислоты. Затем фиксированный материал помещают в постоянный консервант (например, спиртово-глицериновую смесь II).

Для длительного хранения водорослей используют спиртово-глицериновую смесь II с добавлением кристалла тимола. В данный консервант можно переводить также водоросли, содержавшиеся ранее в растворе формалина, смеси формалина и спирта, лактофенола и других фиксаторах, тщательно промыв их в дистиллированной воде. После промывки водоросли помещают на 2-3 дня в спиртово-глицериновую смесь I и затем переносят в более концентрированную спиртово-глицериновую смесь II.

Нежные жгутиковые формы фиксируют парами осмоевой кислоты или ее 1%-м раствором.

Водоросли, инкрустированные известью, хранят в нейтральных консервантах и фиксируют нейтральным формалином (при длительном хранении) или концентрированными растворами, описанными выше. Удобным фиксатором с дополнительным эффектом обезызвествления является следующий спиртовый раствор [651]: 96%-й спирт - 75 мл, дистиллированная вода - 24 мл, концентрированная соляная кислота - 5 мл, ледяная уксусная кислота - 1 мл, хромовая кислота - 0,5 г. После растворения углекислого кальция, водоросли промывают водой до исчезновения запаха уксусной кислоты и переносят в постоянный консервант.

Некоторые водоросли, в частности аэрофитные синезеленые, харовые, крупные зеленые (Cladophorales, Zygnematales и др.), а также водоросли с хорошо развитым слизистым покровом могут храниться довольно долго в высушенном состоянии на стандартных листах, подобно гербарным экземплярам высших растений, или как эксикаты в пакетах (обычно, микроводоросли). Макроскопические водоросли сушат на воздухе в тени, разместив их тонким слоем и расположив их слоевища наиболее естественным образом на бездревесной бумаге, целлофане или на тонких прозрачных листах пластика. При этом водоросли прикрепляются к листу своей слизью, а при ее отсутствии для этой цели используют гуммиарабик, клей ПВА, клейкую ленту типа "скоч" и т. д. В некоторых случаях, особенно при высушивании легкозагнивающих крупных слоевищ водорослей, требуется их предварительная фиксация.

Микроводоросли (например, некоторые зеленые, синезеленые, вызывающие "цветение" воды, и в целом, планктонные водоросли, при отсутствии в пробе большого количества беспозвоночных животных) также можно сохранять в высушенном состоянии [651]. В этом случае материал помещают в коническую пробирку, фиксируют раствором Люголя (см. выше), затем сливают надосадочную жидкость, оставляя слой воды над осадком в 2-3 раза превышающим его толщину, после чего гомогенизируют смесь и заливают пятикратно разбавленным глицерин-желатиновым раствором. Капли пробы переносят на прозрачные пластинки и помещают в эксикатор для испарения воды и высыхания желатины. Высушенные пластинки заливают по сторонам парафином или сохраняют в целлофане, размещая на гербарном листе в пакете. Приготовленные таким образом прозрачные пластинки со слоем застывшей пробы располагают на предметном стекле с каплей воды вниз желатином и после его разбухания исследуют материал.

Правильная фиксация, промывка и подборка наиболее соответствующего консерванта водорослей являются главными условиями длительного хранения альгологических проб в неизменном состоянии (в качестве материала для таксономического определения и сравнения). Альгологическая проба как единица количественного учета представляет собой совокупность видовых и внутривидовых таксонов, собранных одновременно в одном местонахождении и хранящихся в склянке, бумажном пакете, или в виде гербарных образцов, собранных также одновременно в одном местонахождении (пункте, точке). Коллекции фиксированных проб или гербарных образцов водорослей хранят в специальном гербарии - альготеке; они должны соответствовать требованиям длительного хранения по способам фиксации и оформлению документации. Такая альготека, в которой хранятся крупные коллекции, организована в Институте ботаники им. Н. Г. Холодного АН УССР (г. Киев). Она основана в 1934 г. В ее основу положены коллекции водорослей, собранные отечественными альгологами А. В. Топачевским и Я. В. Роллом. В настоящее время основной фонд альготеки насчитывает около 27 тыс. проб. В альготеке хранятся не только водные формы водорослей континентальных водоемов Украины и ряда районов Советского Союза, но и аэрофитные, в основном трентеполиевые водоросли (Ulotrichales), а также некоторое количество морских. Этот коллекционный материал представляет неограниченные возможности как для изучения различных систематических групп водорослей флоры Украины, так и для выяснения многих вопросов экологического, общебиологического и филогенетического характера.

Водные формы водорослей сохраняют в альготеке Института ботаники им. Н. Г. Холодного в склянках из темного стекла объемом 100 мл с плотно навернутыми металлическими крышками, которые покрыты сверху (для исключения испарения фиксатора) полиэтиленовой пленкой, прижатой к горлышку склянки резиновым кольцом. Если объем собранного материала менее 25-30 мл, его помещают в пенициллиновые бутылочки, закрытые резиновой пробкой и полиэтиленовой пленкой. Консервантом является 4%-й раствор нейтрального формалина, приготовленный на дистиллированной воде.

Вневодные формы водорослей (воздушные, водно-воздушные, наземные, водно-наземные) хранят в склянках из темного стекла, заранее наполненных 4%-м раствором формалина, или в бумажных пакетах, сложенных в картонные коробки.

Морские макрофиты, крупные пресноводные и солоноватоводные пластинчастые и трубчатые формы, реже харовые водоросли, высушенные по обычной методике гербаризации цветковых растений, сохраняют, как обычные гербарные образцы, наклеенные или лежащие свободно на гербарных листах, вложенных в "рубашки" из кальки.

Пробы в альготеке имеют две этикетки: внешнюю в виде бланка, изготовленного печатным способом и заполненного тушью, и внутреннюю (рабочую, экспедиционную) - этикетку, написанную простым карандашом. Формат внешних этикеток к склянкам из темного стекла или склянкам для пенициллина 7 × 4,5 см, внутренних - 5 × 4,5 см. В склянках из темного стекла внутренние этикетки, свернутые вчетверо, помещают под резиновой прокладкой металлических крышек, в склянках для пенициллина - между двумя слоями полиэтиленовой пленки, прижатой к горлышку резиновым кольцом. Формат внешних этикеток для пакетов - 11,3 × 9,4 см, внутренних 10 × 7 см, последние лежат в пакетах возле материала. В гербарных образцах к экспедиционным этикеткам, написанным в полевых условиях, добавляют стандартные чистовые этикетки (типографские бланки) размером 11,3 × 9,4 см, заполненные тушью.

Каждой пробе, которая сохраняется в альготеке Института ботаники, соответствует карточка генерального каталога альгологических проб, общие сведения о пробе можно найти в хронологическом каталоге. На обратную сторону карточки генерального каталога, по ходу обработки проб, вносят названия обнаруженных в пробах разными исследователями таксонов водорослей. Существует самостоятельный каталог новых для науки видовых и внутривидовых таксонов водорослей, а в отдельных случаях только новых или редких для альгофлоры УССР и СССР, описанных по материалам альготеки. Все пробы альготеки имеют сквозную нумерацию и хранятся в специальных многосекционных металлических альготечных шкафах оригинальной конструкции с одинаковыми гнездами, на 8-9 см выше склянок, и плотно закрытыми дверцами.