Современные диатомеи

Собранный фиксированный материал по современным диатомеям перед дальнейшей работой с ним в лаборатории следует разделить на две части. Одна часть пробы, в которой среди других диатомей присутствуют формы с тонкоструктурным панцирем, растворимым в кислотах при сжигании органического вещества (очень многие компоненты морского планктона - виды родов Chaetoceros, Rhizosolenia, Bacteriastrum, Lithodesmium и др.), используется для таксономических целей во временных препаратах без специальной технической обработки. В этой же части пробы исследуются типы колоний, распадающихся при кипячении в кислотах, а также изучаются виды диатомей, для определения которых необходимо знать количество и форму хлоропластов и некоторые другие морфологические признаки.

Вторая часть пробы подвергается технической обработке, состоящей в очистке панцирей и приготовлении из них постоянных препаратов. Очистка панцирей производится в 4 последовательных приема: а) очистка пробы от случайных примесей, б) отмывка ее от фиксатора и растворимых солей, в) удаление из пробы нерастворимых солей кальция, г) сжигание органического вещества.

При наличии в пробе случайных примесей: песка, осколков ракуши, обрывков макроскопических растений и животных - необходимо их удалить процеживанием пробы сквозь мелкоячеистое сито с отверстиями 1 мм². Отмывание от фиксатора и растворимых солей производится осаждением содержимого пробы центрифугированием, последующим осторожным отсасыванием пипеткой фиксатора пробы без взмучивания осадка и двукратным центрифугированием в воде. Гербарные образцы следует тщательно размочить, встряхиванием в пробирке снять обрастающие их диатомеи и дальше поступать с ними как и с фиксированным материалом.

В отмытой от фиксатора и растворимых солей пробе нужно удалить нерастворимые в воде углекислые соли (в противном случае при дальнейшей обработке H₂SO₄ они выпадут в виде кристаллов гипса, которые засорят материал и сделают его непригодным для постоянных препаратов). Для этого осадок заливают 10%-й HCl, переносят в высокую пробирку или колбочку, медленно нагревают и кипятят 2-3 мин. Остывшую пробу отмывают повторным центрифугированием до полного удаления следов HCl (проверка лакмусовой бумагой).

Далее проба освобождается от органического вещества. Существует несколько способов сжигания, но наиболее эффективный - кипячение в крепких кислотах. В отмытый от соляной кислоты осадок, по возможности обезвоженный, приливают крепкую (дымящуюся) H₂SO₄ и осторожно переливают в колбочку Эрленмейера или фарфоровый стаканчик, помещают в вытяжной шкаф и кипятят 10-15 мин., а объемный осадок бентосных проб - до 30 мин. К этому времени обугленный осадок начинает светлеть. Для ускорения процесса сжигания в колбочку бросают небольшой кристаллик KNO₃ (или NaNO₃). Прибавлением KNO₃ достигается полное окисление органического вещества, и осадок в колбе обесцвечивается. Если осадок остался серым, значит сгорание органического вещества неполное и необходимо через 2-3 мин. бросить еще кристаллик KNO₃. Остывший белый осадок состоит из чистых панцирей. Его переносят в центрифужную пробирку и тщательно отмывают от серной кислоты повторным центрифугированием в дистиллированной воде до полного удаления следов кислоты (проверка лакмусовой бумагой).

Существуют холодные методы сжигания органического вещества; они не требуют вытяжного шкафа. Один из холодных методов заключается в выдерживании материала не менее ¹/₂ суток в концентрированной H₂SO₄ до его обугливания с последующим добавлением мелких кристалликов K₂Cr₂O₇ до обесцвечивания (Кольбе, 1916). Второй метод (Van der Werff, 1955; Киселев, 1958) состоит в следующем. Пробу помещают в пробирку, добавляют разбавленный раствор хлорного железа и встряхивают. Образующиеся хлопья захватывают с собой диатомеи и другие легкие взвеси, а тяжелые частицы быстро оседают на дно пробирки. Жидкость с хлопьями сливают в другую пробирку и прибавляют несколько капель HCl, растворяющей хлорное железо. Панцири диатомей освобождаются, их промывают и осаждают центрифугированием. Для удаления органического вещества промытый осадок помещают в фарфоровую чашку, заливают пергидролем и накрывают стеклом. Через 5 мин. осторожно прибавляют 1 мг порошковидного KMnO₄ или K₂Cr₂O₇. При действии KMnO₄ образуется осадок водной двуокиси марганца, его растворяют добавлением 10%-й уксусной кислоты. Третий метод предложен Хустедтом (Hustedt, 1958). Он основан на реакции окисления смесью перекиси водорода (H₂O₂) с двухромовокислым калием (K₂Cr₂O₇) или марганцовокислым калием (KMnO₄). Материал, отмытый от фиксатора и солей кальция, помещают в фарфоровую чашку, заливают 30%-й H₂O₂ и закрывают стеклом. Через 5 мин. осторожно прибавляют 1 мг порошка K₂Cr₂O₇ или KMnO₄, образуются пары (они не опасны), и выпадает осадок двуокиси марганца, который растворяют добавлением небольшого количества 10%-й уксусной кислоты. Очищенные панцири отмываются повторным центрифугированием с водой. Для очищения диатомей этим способом требуется всего несколько минут. Четвертый метод был предложен Хенди (Hendey, 1938) для морского планктона, который отличается малым содержанием органического вещества. Осадок пробы, отмытый от фиксатора и солей, помещают в фарфоровую чашку, заливают крепкой H₂SO₄ и накрывают стеклом. Через 10 мин. после обугливания органического вещества добавляют в чашку несколько капель насыщенного раствора KMnO₄, который окисляет обугленное органическое вещество и обесцвечивает осадок. Для полного обесцвечивания добавляют несколько капель насыщенного раствора щавелевой кислоты (после добавления каждого реактива перемешивают жидкость стеклянной палочкой). Когда осадок окончательно обесцветится, его отмывают водой до полного удаления следов кислоты. Аналогичный способ употребляется и при подготовке материала для электронной микроскопии (Hasle, Fryxell, 1970). Холодные способы менее трудоемкие, чем метод кипячения в кислотах, но и менее эффективные.

В последнее время за рубежом начали применять для очистки панцирей от органических веществ ультрафиолетовые лучи и перекись водорода (H₂O₂). Осадок пробы, отмытый от фиксатора и карбонатов, разбавляется дистиллированной водой в кварцевой пробирке. В пробирку наливают 30%-ю H₂O₂, и она помещается в непосредственной близости от источника ультрафиолетовых лучей. Облучение длится 2 часа, температура в пробирке в период облучения не должна превышать 60° (Swift, 1967).

Очищенные панцири сохраняют в спирте или сухими в маленьких пробирках (3 см³), плотно закрытых пробкой и снабженных этикеткой.