Глава I. Методика изучения почвенных водорослей в лесах

Процесс учета почвенных водорослей состоит из ряда этапов, основными из которых являются: 1) отбор почвенного материала; 2) определение видового состава почвенных водорослей; 3) выявление количества водорослей в почве. Принципы методики, используемой на каждом из этапов, изложены в работах М. М. Голлербаха и Л. М. Зауера [1959], М. М. Голлербаха и Э. А. Штиной [1969], Э. А. Штиной и М. М. Голлербаха [1974].

Здесь излагаются особенности методики изучения водорослей в почвах лесных биогеоценозов.

Образцы для анализов отбираются с соблюдением всех требований микробиологических исследований. Пробы берутся из подстилок и верхних горизонтов почвы послойно через каждые 5 см до глубины 15 см, так как под лесами именно этот слой является наиболее биологически активным (здесь расположены основная масса сосущих корней растений, микроорганизмов и почвенных животных). К тому же экспериментальные данные показали, что для получения представительной характеристики альгофлоры лесных почв глубина отбора проб должна быть не меньше 10 - 15 см. Если ограничиться анализом лишь верхнего 5-сантиметрового слоя почвы, будут получены заниженные данные, особенно по составу водорослей. Это связано, во-первых, с тем, что на глубинах 5 - 10 и 10 - 15 см число видов водорослей еще довольно значительно и должно быть учтено. Во-вторых, в состав водорослей этих слоев входит целый ряд видов, разнообразие которых возрастает именно на этих глубинах и которые могут быть не выявлены при взятии лишь поверхностных образцов почвы.

Кроме того, было установлено, что особенно неравномерно распределяются водоросли в самом верхнем горизонте почвы, где часто приходится сталкиваться с микростратификацией водорослей. В связи с этим альгологическому анализу желательно подвергать не средний образец из всего рекомендуемого для изучения 15-сантиметрового слоя почвы, а целесообразно выполнять послойные (через каждые 5 см) определения состава и количества водорослей. Значительно заниженные данные, полученные Т. С. Носковой [1972] при определении количества водорослей во всем слое толщиной 0 - 10 см по сравнению с результатами анализа отдельных составляющих его слоев 0 - 3 и 3 - 10 см, еще раз свидетельствуют в пользу послойного определения состава водорослей в лесных почвах в пределах верхнего горизонта.

Для изучения закономерностей вертикального распределения почвенных водорослей пробы почвы отбираются по всем генетическим горизонтам.

Во время сбора образцов проводится описание пробных площадей (состояние растительности, степень покрытия поверхности почвы, наличие или отсутствие поверхностных разрастаний водорослей, наблюдаемых визуально, наличие свежего опада и некоторые другие признаки), измеряется температура в исследуемых почвенных горизонтах. В отобранных образцах определяется влажность и рН. Желательно измерение освещенности поверхности почвы на пробных площадях.

При изучении водорослевых сообществ лесных биогеоценозов необходимо решение некоторых методических вопросов, в частности, способа отбора полевого материала для получения надежных и достоверных результатов. В нашем случае отработка методики проводилась в биогеоценозе с ярко выраженной пестротой растительного покрова - дубо-ельнике волосистоосоковом. Для более полного отражения сложного состава растительности работа выполнялась в парцеллах, сформированных различными растениями-эдификаторами и представляющих одну из групп парцелл, выделенных в данном типе леса [Бязров и др., 1971]. Из хвойных парцелл, занимающих наибольшую площадь, была исследована елово-волосистоосоковая - основная в дубо-ельнике, из лиственных - осиново-снытевая, из травянистых - крупнопапоротниковая в окне. Отработав методику на биогеоценозе со сложной растительностью, в дальнейшем можно было пользоваться такими же методическими подходами при изучении альгофлоры в лесах с более однородной структурой.

В каждом исследованном типе парцелл из прикопок площадью не менее 15 х 15 см² отбирали по 5 почвенных образцов. Учитывая, что по мере удаления от ствола дерева изменяются величина опада и запаса подстилки, количество и концентрация просочившихся сквозь крону осадков, а также свойства почвы, особенно ее верхних горизонтов [Карпачевский и др., 1968], и наблюдается перестройка в группировках водорослей [Чаплыгина, 1977], отбор проб во всех парцеллах проводили по единой схеме. Каждый образец почвы обрабатывался отдельно, одновременно анализировались и смешанные пробы.

Экспериментальные данные (табл. 1) были подвергнуты статистической обработке [Урбах, 1964; Дмитриев, 1966]. Точность определений для общего числа видов оказалась довольно значительной: относительная погрешность не превышала 7,1% при вероятности 90% и 9,4% при вероятности 95%. С меньшей точностью было найдено число видов по отделам: здесь наибольшая точность в 90 случаях из 100 колебалась от 8,6 - 8,8% для наиболее разнообразных в почве этого леса зеленых и желто- зеленых водорослей и до 12,4 - 18,1% для значительно слабее представленных сине-зеленых и диатомовых водорослей. При вероятности 95% относительная погрешность увеличивается. В случае единичного обнаружения водорослей точность оказывается очень низкой.

Надежным показателем для оценки разбросанности данных является коэффициент вариации (V) [Дмитриев, 1972]. Колебания между различными повторностями для общего количества видов (V = 6 - 8%) и для числа видов обильно развивающихся отделов (V = 9 - 16%) относительно невелики. Чем слабее представлены в почвах данного типа леса те или иные отделы водорослей, тем значительнее рассеянный вариант. Очевидно, для более точного учета таких групп водорослей необходима значительное число повторностей. Так как наибольшие коэффициенты вариации и наименьшая точность определений были получены для отделов Cyanophyta и Bacillariophyta, встречающихся в основном в подстилке, видовой состав в ней изучался и в 10-кратной повторности. Это позволило несколько снизить варьирование данных и до двух раз уменьшить относительную погрешность определений, хотя она и в этом случае осталась довольно низкой.

Исходя из полученных данных, сделан расчет необходимого количества повторностей, которое при сходных методах изучения водорослей можно рекомендовать для получения определенной точности исследований при заданной доверительной вероятности (табл. 2). В лесах с довольно однородной структурой для характеристики общего флористического состава почвенных водорослей с точностью не ниже 10% следует проводить отбор образцов не менее чем с 5-кратной повторностью. Получение большей точности требует увеличения объема выборки до 9 - 13 проб. Идентификацию водорослей некоторых отделов желательно проводить с 9-кратной повторностью для почвенных горизонтов и 15 - 16-кратной повторностью для подстилки. Такая схема отбора образцов обеспечивает значительную точность определения при достаточно высокой доверительной вероятности почти для всех отделов водорослей, даже если они представлены небольшим числом видов.

Таблица 1

^*(Результаты статистической обработки 10 индивидуальных проб.)

Обработка большого числа различных выборок, составленных по материалам дубо-ельника, показала, что для характеристики альгофлоры лесного биогеоценоза со значительной пестротой растительного покрова отбор проб должен проводиться во всех группах парцелл (например, хвойных, лиственных, травянистых), при этом в основных следует собирать образцы не менее чем из пяти точек, в дополнительных - не менее чем из трех. Наше заключение совпадает с указаниями Н. В. Дылиса [1969, с. 39] о том, что "при изучении биогеоценозов дополняющие парцеллы нуждаются в учете и анализе наравне с основными парцеллами". Учет массы мхов, проведенный в дубо-ельнике по лесным парцеллам, тоже дал более точные результаты [Успенская, 1966].

Таблица 2

Следует отметить, что число видов водорослей, обнаруженное в основной парцелле, наиболее близко к среднему числу видов, выявленному для всего дубо-ельника.

При большом количестве вариантов анализ каждой повторности в отдельности практически не осуществим, поэтому при общей оценке состава почвенной альгофлоры лесного биогеоценоза целесообразно прибегать к изучению смешанного образца почвы, составленного из указанного выше количества индивидуальных проб [Дмитриев, 1972]. Проведенное нами сравнение результатов анализа смешанного образца и отдельных повтор- ностей показало, что как по доминирующим, так и по относительно малообильным видам списки водорослей в том и другом случае совпадали.

Однако при решении некоторых вопросов, например таких, как выявление максимального количества видов водорослей в данной растительной ассоциации, выяснение влияния отдельных растений - эдификаторов на водорослевое сообщество, изучение изменчивости водорослевых группировок в пределах относительно небольших площадей, а также при создании единой биокомплексной карты [Новичкова-Иванова, Сдобникова, 1968], вероятно, недостаточно ограничиваться анализом смешанного образца почвы и необходимо проведение подробного исследования каждой пробы в отдельности.

Так как определение видового состава и численности водорослей наиболее ценно проводить параллельно, т. е. из одних и тех же образцов, требовалось выяснить, пригодна ли подобная схема сбора материала и для подсчета клеток водорослей. Статистический анализ показал, что при определении численности водорослей для получения результатов с 10% точностью при доверительной вероятности 95% требуется отбирать не менее 6 - 9 образцов из почвенных горизонтов и не менее 9 - 15 проб из подстилки.

В последнее время в почвенной альгологии проведен ряд методических исследований, посвященных вопросам распределения водорослей в почве и методам отбора средней пробы [Штина, Голлербах, 1974, 1976а; Домрачева, 1974, 1975, 1977; Маркова, 1976; Некрасова, Бусыгина, 1977, 1979; Куксн, 1977; Кабиров, 1978; Кабиров, Минибаев, 1978; и др.]. При большой учетной площади (100 м²) и больших размерах почвенных монолитов исследование показало случайное размещение водорослей. На малых пробных площадях (1 м²), обнаружено контагиозное, или пятнистое, распределение водорослей, обязанное особенностям размножения, когда клетки водорослей остаются рядом друг с другом [Домрачева, 1977]. Существенное влияние на характер распределения водорослей оказывает также нанорельеф почвы.

При решении вопроса о размере выборки, репрезентативно характеризующей генеральную совокупность, в большинстве исследований последних лет, в частности во всех упомянутых методических работах, отбору индивидуальных образцов предпочитают среднюю пробу. К. А. Некрасова и Е. А. Бусыгина [1977] проводили исследования на дерново-подзолистых почвах и выработанных торфяниках и установили, что средние данные, полученные от обработки 10 и 25 индивидуальных проб, имели высокий коэффициент вариации - 40% и значительную ошибку опыта - 13 - 23%. Повышение точности могло быть достигнуто путем увеличения числа индивидуальных проб, что лежит за пределами практической осуществимости, или путем составления смешанного образца. В свою очередь последний мог быть составлен из большого числа (до 100 - 200) мелких индивидуальных образцов с площадью 1 см², либо из меньшего числа (не более 5) образцов с площадью 25 см², взятых способом конверта. По мнению авторов, достоинством смешанного образца было устранение влияния неравномерности пространственного распределения водорослей на характеристику средних данных.

Разные авторы составляли усредненный образец из разного числа индивидуальных почвенных проб: Помелова [1971] - из 6 - 8, Домрачева [1974] - из 15-20, Маркова [1976] и Манылова, Неганова [1977] - из 10, Кабиров [1978] - из 80. Для выработанных торфяников Бусыгина [1975] ограничилась пятью пробами с площадью 25 см². Шушуева [1977] для отвалов угольных карьеров составляла смешанную пробу из 5, а в случае щебнистых грунтов из 10 индивидуальных площадью 10 см². Во всех случаях пробы берут рендомизированно способом случайного отбора или располагают места отбора проб в шахматном порядке, не приурочивая их к массовым разрастаниям водорослей.

Различные виды водорослей специфичны по своей биохимической природе и экологическим особенностям, поэтому видовой состав в значительной мере определяет роль водорослевой синузии в метаболизме биогеоценоза в целом. Кроме того, определение видового состава водорослей является первым этапом любого почвенно-альгологического и фитоценологического исследований [Голлербах, Зауер, 1959; Штина, 967; Воронов, 1973]. Следует учитывать также, что видовой состав водорослей - достаточно постоянный признак для характеристики лесного фитоценоза [Штина, 1959б]. В связи с этим значительная часть работы была посвящена изучению флористического состава водорослей в исследуемых типах леса.

Определение видового состава водорослей проводилось методом водных, чашечных культур со стеклами обрастания [Lund, 1945] и прямого микроскопирования. Для выращивания культур использовалась в основном среда Данилова, приготовленная не на садовой почве, как принято, а на вытяжке из исследуемых почв, чтобы иметь для развития водорослей условия, наиболее соответствующие естественным. В колбах, засеянных подстилкой, отмечался очень медленный рост и слабое развитие водорослей, особенно таких отделов, как Cyanophyta и Bacillariophyta. Причиной этого могло быть довольно низкое значение pH среды, поэтому было испытано несколько сред с заведомо известной нейтральной реакцией, а также подщелачивание используемого раствора Данилова, посев в обогащенную среду Данилова и в среду Данилова на садовой почве. Значительного эффекта большинство испробованных вариантов не дали. Некоторая активизация роста была отмечена при инокуляции подстилки в классическую среду Данилова на садовой почве и небольшое ускорение развития - при подщелачивании используемого раствора Данилова. Видовой состав при всех испытанных способах оказался сходным. Это дало основание в дальнейшем с целью создания однотипных условий выращивания и для подстилки применять в основном среду Данилова на вытяжке из исследуемой почвы с параллельным использованием в некоторых случаях среды Данилова на садовой почве. Колбы инкубировались при естественном освещении и при дополнительном искусственном освещении люминесцентными лампами.

Культуры просматривались многократно за период их развития, начиная с двухнедельного возраста и кончая сроком не ранее 6 месяцев после высева. Препараты для микроскопирования готовились из налетов водорослей на поверхности, по урезу среды, на боковых стенках и дне колбы, из самого раствора. С целью сохранения какого-либо препарата для вторичного просмотра он помещался во влажную камеру, приготовленную в чашке Петри. При необходимости для более точной идентификации некоторые виды водорослей выделялись в чистые культуры.

Сочетание разных методов исследования позволяет, с одной стороны, более полно и точно выявить все виды водорослей, а с другой - определить доминирующие группы водорослей, которые прежде всего характеризуют конкретную альгосинузию [Голлербах, Штина, 1969; Новичкова-Иванова, 1980]. Визуальная оценка обилия каждого вида проводилась по шкале Друде, используемой как в геоботанических [Раменский, 1971], так и в альгологических исследованиях.

Выявление видового состава водорослей - это лишь одна сторона характеристики водорослевых группировок. Более полное представление о динамике их развития, степени участия в различных процессах, а следовательно, и о роли водорослей в лесных почвах можно получить при одновременном изучении и количества водорослей.

Определение количества клеток водорослей во всех случаях проводилось методом прямого счета, основанном на методике С. Н. Виноградского [Штина, 19566; 19606; Голлербах, Штина, 1969]. Этот метод является достаточно трудоемким. В настоящее время все более широкое распространение получает метод прямого счета с помощью люминесцентного микроскопа, предложенный Чэном [Tchan, 1952, 1953] и дополненный и усовершенствованный Г. И. Помеловой [1969]. К сожалению, ряд моментов, наиболее существенным из которых является невозможность подсчета в люминесцентном микроскопе фиксированного формалином материала, не позволил нам воспользоваться этим более быстрым способом количественного учета водорослей (массовые летние сборы приходилось обрабатывать зимой). Однако полученные нами данные являются хотя и несколько заниженными, но того же порядка, что и величины, найденные с помощью люминесцентного микроскопа, как это было показано Г. И. Помеловой [1969], и поэтому представляют достоверную количественную характеристику изучаемых водорослевых группировок.

Обработка и подготовка почвы проводилась по общепринятой методике, а для подстилки пришлось ввести некоторые изменения. Подстилочный материал, из которого были выбраны включения в виде веток, шишек, стеблей мха и пр., тщательно измельчался. К размельчению образцов прибегают также при работе с торфом [Антипина, 1979] или моховым покровом в тундре [Перминова, 1980]. Для подстилки почти во всех случаях отбирали в склянки навеску по 0,5 г. Перед взбалтыванием содержимое пузырьков тщательно растирали в фарфоровой ступке. Проводили многократное промывание осадка. Первые порции взбалтывали не меньше трех минут, отстаивали около 1 мин. Затем время взбалтывания уменьшалось постепенно до 1 мин, а отстаивание - до полминуты. Центрифугирование продолжалось не менее 3 - 4 мин., иногда проводилось повторно. При подсчете клеток водорослей под микроскопом просматривалась каждая третья полоса, равная по ширине диаметру поля зрения микроскопа.

Значительные трудности представляет распознавание клеток водорослей, особенно зеленых и желто-зеленых, среди почвенных частиц. Была предпринята попытка подыскать краситель, который при минимальном засорении поля зрения и прокрашивании частиц почвы, дал бы довольно быструю и прочную окраску водорослевых клеток. Испытывались несколько основных и кислых красителей [Федоров, 1957; Скородумова, 1962; Бычкин и др., 1964]. Наилучшие результаты получены при применении эозина спирторастворимого. Для приготовления краски эозин растворяли в 70° спирте [Наумов, Козлов, 1954]. Опробировалось несколько концентраций раствора красителя и внесение его на разных этапах подготовки почвенной навески к счету. Наиболее приемлемым оказался следующий способ окрашивания материала. Несколько капель (до 0,5 мл) 0,1%-ного раствора эозина закапывается в пробирку на 20 мл, в которую слита суспензия из центрифужных пробирок. Смесь взбалтывается, выдерживается в течение 15 - 20 мин, доливается бидистиллятом до 20 мл и дальше проводится подсчет клеток по обычной схеме.

В результате окрашивания зеленые и желто-зеленые водоросли (клетки с содержимым внутри) приобрели розовый цвет, пустые клетки и споры остались неокрашенными. Сине-зеленые водоросли порозовели, но не очень сильно; содержимое диатомей приобрело розовый оттенок, пустые клетки не окрасились; простейшие стали бледно-розовыми. При увеличении времени обработки образца красителем начинает прокрашиваться и почвенный фон, что может исказить наблюдаемую картину.

Все расчёты количества клеток водорослей проводились на абсолютно сухую почву для получения сопоставимых результатов.