Культуральные методы исследования состава почвенных водорослей

При выявлении видового состава водорослей используются разные варианты культурального метода. Задача культивирования в данном случае заключается в получении интенсивного роста всех имеющихся в почве водорослей, чтобы иметь достаточное количество особей каждого вида, находящихся на разных стадиях онтогенеза, для наблюдения, описания и идентификации. При этом обнаруживаются как виды, представленные активными стадиями, так и виды, сохраняющиеся в почве в покоющемся состоянии - в форме спор или цист. При постановке культур почвенных водорослей применяют общепринятые приемы микробиологической техники, касающиеся стерильности посуды, питательных сред, воды и инструментов. Инкубацию культур проводят обязательно на свету.

Наиболее простым методом для выявления состава почвенной альгофлоры является метод "стекол обрастания". Исследуемую почву, по возможности в ненарушенном состоянии, помещают в стерильные чашки Петри и в увлажненном состоянии выдерживают на свету. Для увлажнения применяют дистиллированную воду или минеральную среду (см. список наиболее употребительных сред).

На поверхность почвы (одновременно с постановкой культуры или на следующий день) раскладывают стерильные покровные стекла в количестве 4-8 на чашку. Поверхность почвы в чашке должна быть в мелких неровностях, ее не следует уплотнять и заглаживать. Между стеклами и почвой должны оставаться небольшие свободные пространства - "влажные камеры". Почву периодически увлажняют до 80% от полной влагоемкости. На нижней поверхности "стекла обрастания" начинается развитие водорослей, преобладающих в данной почве. Обычно уже через 4-5 дней можно начинать просмотр стекол под микроскопом. Для этого покровное стекло снимают с поверхности почвы пинцетом и, удалив с него крупные частички почвы, кладут на предметное стекло в каплю воды. Целесообразно просматривать не все стекла одновременно, а последовательно, с промежутками в 3-5 дней. Для полного выявления видового состава водорослей в почве достаточно 3-6 недель инкубации. К этому сроку стекла так интенсивно зарастают водорослями, что поселение каких-либо новых видов оказывается невозможным.

На стеклах обрастания быстро размножаются диатомеи, и стекла можно без дополнительных процедур попользовать для приготовления постоянных препаратов.

Для приготовления водных культур используют питательные среды, содержащие все необходимые для роста водорослей элементы, в частности, азот, фосфор, серу, магний, железо, калий, кальций и микроэлементы.

Разработано множество питательных сред, применительно к тем или иным группам водорослей (см. раздел Рецепты питательных сред) и техника различных культур.

Готовые питательные среды разливают по колбам из расчета 50-80 мл раствора на колбу емкостью в 100-150 мл. Удобнее всего пользоваться коническими колбами, но пригодна и другая посуда. Закупоренные ватными пробками колбы стерилизуют в автоклаве при 110° в течение 20 мин. Для посева берут определенную навеску почвы (обычно 1-2 г) или определенный объем почвы. Желательно применять принцип средней пробы из каждого данного образца и 2-3-кратную повторность культур. Можно засевать воздушно-сухую почву, но наилучшие сроки хранения, по-видимому, различны для неодинаковых почв и групп водорослей.

Развитие водорослей в водных культурах обычно становится заметным после 2-3 недель инкубации на свету. Наблюдается последовательность появления и исчезновения видов в культурах, что определяет необходимость многократного просмотра водорослей по мере их развития, начиная с трех недель и кончая 3-4 мес.

Для приготовления препаратов при изучении водорослей берут на предметное стекло пробы налетов и пленок со дна и стенок колб, с поверхности и из толщи раствора, соблюдая обычные приемы стерильности.

Агаровые культуры. Питательные среды с 1,5-2% агара применяются как для поддержания чистых культур, так и для выделения водорослей из почвы, которую наносят на поверхность агара в виде почвенного мелкозема (Громов, 1957). На агаре хорошо разрастаются диатомовые, зеленые и сине зеленые водоросли, в том числе спорообразующие формы, медленно растущие на стеклах. Поскольку вокруг каждой мелкой почвенной частицы вырастает немного видов водорослей, а иногда только один вид, то с агаровых культур легко выделить альгологически чистые культуры. Инкубация всех культур проводится на свету. Чаще всего для инкубации служат различной конструкции люминостаты.

Разные виды культур имеют свои достоинства и недостатки. Так, водные культуры, хорошо выявляя общий состав обитающих в почве водорослей, могут дать неправильное представление о количественных соотношениях между видами и о доминирующих формах. Коррективы в эти представления вносят почвенные культуры со "стеклами обрастания", выявляющие, в первую очередь, массовые и жизнедеятельные формы, или прямые наблюдения свежевзятой почвы. Необходимо учитывать, что во всех описанных культурах, особенно в почвенных, наряду с водорослями, хорошо развиваются протонема мхов, а иногда и заростки папоротников из спор, находящихся в почве.

Альгологически чистые культуры водорослей. Нередко для идентификации вида и изучения физиологических и экологических его особенностей необходимо получение альгологически чистых культур, т. е. культур, в которых содержится одновидовая популяция водорослей, но могут присутствовать разнообразные гетеротрофные организмы. Бактериологически чистые культуры, необходимые для физиолого-биохимических исследований, получить значительно труднее.

Выделение альгологически чистых культур производят разными способами: путем последовательных пересевов на агаровые среды и проведения материала через отдельную колонию с помощью обычной микробиологической техники; с помощью микропипетки, извлекающей из смеси водорослей отдельную клетку или колонию. Альгологически чистые культуры водорослей получают и на мембранных фильтрах, на которых из смешанной культуры выделяют с помощью волоска нужные клетки при просмотре под микроскопом.

Их хранят обычно в специальных коллекционных люминостатах при пониженной температуре на свету и периодически пересевают. Основные учреждения СССР, располагающие коллекциями почвенных водорослей: Биологический институт ЛГУ (ст. Петергоф), Ботанический институт АН СССР им. Комарова, Институт ботаники АН УССР, Институт микробиологии АН СССР, Кировский сельскохозяйственный институт (кафедра ботаники), Институт физиологии растений АН СССР.