Микроскопирование препаратов

Изучение структуры панцирей и створок диатомей в целях их таксономического определения производится в световом (оптическом) микроскопе, имеющем иммерсионный объектив. Разрешающая способность светового микроскопа позволяет видеть до 36 структурных элементов в 10 мкм, что вполне достаточно для определения тонкоструктурных видов.

Этому требованию отвечают исследовательские биологические микроскопы: МБИ-1, МБИ-3, МБР-1, МБР-3, МББ-1, МББ-1А, МБИ-6, МБИ-11, МБИ-15, Биолам (микроскопы этой серии отличаются друг от друга комплектацией), Amplival (Zeiss, ГДР) и др. Можно даже применять экспедиционный монокулярный микроскоп МБД-1. Необходимо пользоваться объективами масляной иммерсии 90 или 100 с апертурой 1.25-1.40 и окулярным микрометром. Для общего просмотра препаратов и измерения очень крупных створок удобен объектив масляной иммерсии 60. Устройству микроскопов различных систем и обращению с ними посвящена обширная литература (Роскин, 1951; Наумов, Козлов, 1954; Савин, 1954; Федин, 1963; Петров, 1973, и др.). Ниже даются некоторые практические указания, которые следует учитывать при микроскопировании диатомей.

Измерение объекта (панциря и створки) производится с помощью окулярного микрометра. Цена делений линейки микрометра различна при разных объективах, необходимо определить ее при объективе 40 (для измерения крупных панцирей и створок) и при иммерсионных объективах 90 и 60 (для измерения мелких створок и количества элементов структуры в 10 мкм). Для этого на предметный столик микроскопа помещают объект- микрометр с линейкой длиной 1 мм, разделенной на 100, каждое деление равно 0.01 мм. Устанавливая при избранном объективе параллельно окулярную и объективную линейки, определяют цену одного деления окулярного микрометра. Необходимо при этом установить тубус на делении 160 (см.: Определитель пресноводных водорослей, 1951, 1; Наумов, Козлов, 1954).

Для правильного горизонтального и вертикального передвижения препарата микроскоп должен быть снабжен препаратоводителем (ст-12), укрепляемым на предметном столике микроскопа. С помощью препаратоводителя просматривается 5-10 рядов или весь препарат без пропусков, при этом исключается повторный просмотр полей зрения, что важно при количественном учете диатомей. Кроме того, с помощью нониусов координат препаратоводителя устанавливается точное положение объекта в препарате. Приступая к работе, необходимо закрепить винты подвижного столика микроскопа и центрировать его по кресту центрировочной пластинки. Только тогда точные координаты препаратоводителя будут сравнимы между собой и позволят тотчас найти нужный объект на препарате по записанным координатам. Однако, перенося этот препарат на иной микроскоп для фотосъемки или демонстрации объекта, полезнее обеспечить быстрое нахождение объекта путем отметки (маркировки) его на препарате.

Существует два способа маркировки. Первый из них не требует никаких приспособлений. Поставив объект в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении, наносят тонким чертежным пером на покровное стекло препарата над объектом маленькую точку тушью. Сняв препарат, оконтуривают отмеченный точкой объект несмываемой тушью на покровном стекле или на нижней поверхности предметного стекла. Можно оконтуривать объекты разными фигурами - кругом, треугольником, четырехугольником и пр. Если тушь смываемая, ее покрывают тончайшим слоем лака. Второй способ требует особого приспособления - цилиндра, по форме и размерам повторяющего оправу объектива. Цилиндр вставляется в револьвер микроскопа на место одного из объективов. На свободном конце цилиндра к его краю припаян стержень с алмазом. Вращая цилиндр, описывают алмазом круг, оконтуривающий объект, и обводят круг тушью (Møller, 1967). Если в препарате отмечено несколько створок или панцирей, то нужно снабдить его этикеткой-планом расположения видов. Можно отмечать положение объекта в препарате с помощью "механического искателя" (mechanical finder - Wornardt, 1965), не маркируя его тушью.

При таксономической обработке диатомей необходимо определять все виды; недостаточно указывать только 2-3 вида из числа так называемых "руководящих" или определять виды легко определимые, а трудно определимые оставлять как sp. sp. Такой способ обработки не дает представления о диатомовой флоре водоема и внушает недоверие к определениям.

(Примечание. Ископаемые диатомеи, встреченные единичными экземплярами, притом не всегда хорошей сохранности, лучше отмечать знаками открытой номенклатуры: affine (если найденный вид отличается от описанного в литературе) или conformis (если панцирь или створка имеют плохую сохранность), например Navicula aff. lagerstedtii CL, Diploneis cf. didyma Ehr., а не описывать как новые виды, что приводит к излишней синонимике.)

Новые методы световой микроскопии - фазово-контрастный и люминесцентный - не дали ничего нового для исследования структуры панциря. Фазово-контрастная микроскопия позволяет значительно увеличить видимость малоконтрастных объектов и получить очень хорошие результаты при изучении протопласта. Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия используется для цитологических исследований протопласта, а также в гидробиологических работах для распознавания живых и мертвых клеток (Замков, 1948; Горюнова, 1951, 1952, 1956, 1961; Миронов, 1954; Брумберг, 1955; Брумберг, Черноградская, 1963; Давыдова, 1966; Давыдова, Петрова, 1967).

С начала 40-х годов текущего столетия для изучения тонкой структуры панциря диатомей применяют электронный микроскоп, увеличение и разрешающая способность которого в десятки раз превышают таковые светового (оптического) микроскопа. До настоящего времени исследованы панцири и створки примерно 1000 видов и разновидностей. Полученные данные используются для классификации структурных элементов и уточнения таксономического положения видовых и внутривидовых таксонов (Kolbe, 1948-1951; Okuno, 1950, 1954-1959; Helmcke, Krieger, 1953-1970; Ross, 1963a, 1963b; Hasle, 1965). В последние годы появились электронно-микроскопические исследования протопласта диатомей, показавшие мельчайшие неизвестные раньше структуры и органоиды клеток (см. выше). Общими руководствами по электронной микроскопии могут служить: Drummond, 1950; Hendey a. oth., 1954; Кушнир, 1957; Машанский, 1963; Методы цитологических исследований, 1963; Drum, 1969. Приготовление препаратов для изучения протопласта и панциря, получение контрастности изображения с каждым годом совершенствуются в применении к определенному объекту исследования, поэтому в публикуемых статьях всегда указывается техника приготовления материала по диатомеям (Drum, Pankratz, 1963а, 1964а, 1964b; Stoermer, Pankratz, 1964; Stoermer a. oth., 1964, 1965a, 1965b; Reimann a. oth., 1965-1966; Reimann, Volcani, 1967, и мн. др.).

Во второй половине 60-х годов для исследования панцирей диатомей стали применять сканирующий электронный микроскоп, известный в технике с начала 50-х годов (Smith, Oatley, 1955; Oatley a. oth., 1965; Thornton, 1965; Oatley, 1966; Cosslett, 1967; Кларк и др., 1969; Спивак и др., 1969; Снигиревская, 1971). Этот микроскоп имеет большие преимущества перед световым и трансмиссионным электронным микроскопами: 1) возможность изучения объекта под разными углами зрения, рельефа и структуры его внешней и внутренней поверхности и в оптическом разрезе, получения объемного трехмерного изображения благодаря большой глубине фокусного расстояния (в 500 раз больше, чем у светового микроскопа - Wornardt, 1970); 2) большой диапазон увеличения: у японского сканирующего микроскопа (JSM-2) от 100 до 100 000, у английского (Cambridge Stereoscan MK IIa) - от 20 до 50 000, позволяющий легко обнаружить любой объект сначала при малом увеличении, а затем перевести на большее увеличение для исследования ультраструктуры; 3) простая техника подготовки препарата для просмотра, не требующая массового материала одного вида, и 4) возможность сохранения оригиналов.

Эти качества сканирующего электронного микроскопа свидетельствуют о перспективности его для изучения панцирей диатомей. В результате исследований ряда авторов (Ehrlich, 1969а, 1969b; Miller, 1969; Hasle, Heimdal, 1970; Ross, Sims, 1970, 1971; Wornardt, 1970) получено много новых ценных данных по ультраструктуре диатомей.